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克罗恩病(CD)的一个特征是肠外“爬行脂肪(CrF)”，定义为发炎和纤维化的肠道周围的肠系膜脂肪组织扩张。Cell上发表一篇题为“可变肠道菌群向肠系膜脂肪的易位驱动人类蠕动脂肪的形成”的文章，探索CD中的微生物易位是否是慢性肾功能衰竭发生的中心线索。
论文ID
题目：TranslocationofViableGutMicrobiotatoMesentericAdiposeDrivesFormationofCreepingFatinHumans
译名：可变肠道菌群向肠系膜脂肪的易位驱动人类蠕动脂肪的形成
期刊：Cell
IF：38.
发表时间：.9
通讯作者：SuzanneDevkota
DOI号：10./j.cell..09.
主要内容
1元基因组测序揭示细菌易位，发生在CD和健康MAT中但轮廓和功能不同
作者选取了11例因CD并发症接受手术切除的患者，并从每个患者收集配对受累和相邻的未受累回肠段(CDiMUC和uMUC)、附着的CrF、相邻的未受累的肠系膜脂肪(CDMAT)及血液共5个部位样品(图1C)。此外，我们还收集了13例无CrF的UC患者的类似区域、受累/非受累结肠(UCiMUC和uMUC)和UCMAT作为对照。我们还从4例非IBD结肠手术后行回肠造口的受试者的回肠粘膜(HMuc)、附着垫(HMAT)和血液中获得了健康组织对照(HMuc)和附着垫(HMAT)。这些样本的系统的处理和分析工作流程参见图1C。表S1详细说明了患者信息数据，包括临床特征、用药情况、家族史、社会史和研究队列的基本信息。我们对一组患者进行了深度鸟枪式元基因组测序，以首先评估在肠系膜脂肪中是否可以检测到细菌DNA，如果可以，这是CD患者特有的还是自然发生的。从CD(n=4名患者，4个组织部位)和H(n=4名患者，2个组织部位)的24份成对脂肪和粘膜样本(图1C)中，总共鉴定出个组织分类群。通过使用Source-Tracker2方法，排除了MAT中的细菌足迹来自环境污染，确定了样本粘膜和脂肪序列与粪便样本的比对最接近(图2A)。α多样性是区分CD和H样品的关键特征。尽管使用相同数量的脂肪组织构建文库，但HMAT与CDMAT相比细菌计数一直较低，但HMAT在归一化后保持了比CDMAT更高的多样性(图2B，最左边)。这与CDiMUC中微生物多样性与对照组织相比降低的研究结果一致，作者在这里发现，粘膜多样性降低与MAT中更大的生物边界相关。受累或非受累部位的MAT和MUC之间CD内α多样性没有显著差异(图2B，左中和右中)。在组织对照中也观察到类似的情况(图2B，最右边)。β多样性分析表明，虽然数据集中有很高的个体间变异性但样本的群落结构在很大程度上可以根据疾病和组织状况分开。使用MetaCyc通路研究了CD和H中元基因组的代谢潜力，并使用Songbird多项式回归对它们进行了排序。分析表明与CD和H相关的微生物群对碳源和氮源有不同的偏好。特别是，CD组明显富含蔗糖利用的途径及与硫代谢有关的途径，而在H对照的微生物群中，则富集了与肠道健康有关的过程，如纤维发酵和维生素B6合成(图2C)。
图一：CD中CrF的定义特征。
2细菌和真菌模式区分组织间隔和疾病状态
虽然CD和H组之间的微生物存在差异，但这可能是一般慢性肠道炎症的指示，而不是CD的特定特征。因此收集了另一类UC患者但没有发生Crf的慢性肠炎的样本并进行了16SrRNA测序。如元基因组数据所示，CDCrF和MAT，相对于配对的MUC没有显著差异，而UC组比MAT在MUC分类组上，以及所有CD样本具有更大的多样性(图2D)。这可能反映出与小肠相比，结肠的细菌含量更高。为了进一步确定MAT中的细菌是否实际上来自肠道，我们将CD和UC在MAT中鉴定的分类群与它们各自的MUC进行了比较，并寻找重叠的分类群和离群值。使用Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)显示，在CD或UC切除中，MUC和MAT之间没有唯一的聚类，表明这些位点的微生物区系之间没有显著差异。在单个分类群水平上，MAT来源的细菌在CD和UC中都与MUC微生物群的成员进行了系统发育比对(图2E)，这表明MAT不是一个新的微生物生态位，而是从肠道转移到邻近的MAT。与相邻的CDMAT和下面的CDMUC相比，慢性阻塞性肺疾病的标本明显地表现出丹*丝菌科的丰度的升高。除了细菌序列，在CD和UC的所有MAT标本中也发现了真菌DNA，但观测到的ITS数量没有显著差异(图2F)。PCoA显示，真菌群落在很大程度上是由标本位置(MAT与MUC)分开的(图S2C)，这表明虽然总体真菌多样性没有疾病或组织特异性，但群落结构反映了组织位置的差异。例如，酿酒酵母和近平滑念珠菌的相对丰度在MAT标本中都相对较高(图2G)，而限制性马拉色菌则是CDMUC样本的标志菌株。
图二：MAT不同肠道来源的多样微生物群。
3回肠CDMUC和CrF具有独特的可培养菌群区系
为确定在MAT上鉴定的序列是否来可培养微生物，假设这些生物的基因组和功能特征可以为了解CrF的微环境提供有用信息。于是他们从9/11名CD患者和9/13名UC患者的MAT中分离了活的细菌，还从4/4HMAT对照中分离活细菌(图3A)。这样一共从CD和UCMAT中分离了个菌，经测序分析鉴定后，可分类归属到84个物种中。当将可培养细菌与扩增子测序鉴定的细菌重叠时，两种方法都可以检测到的有41种细菌，而其他的只能通过测序或培养来检测到(图3B)。例如，Akk菌和普拉梭菌主要通过测序而不是通过培养检测到。这表明许多肠道微生物可以移位到MAT上，但只有一小部分细菌仍然活着，或者这些细菌在给定的菌体衍生条件下可能改变了与其类型菌株不同的代谢需要。我们从MAT上发现了两个活的真菌分离株，白色念珠菌和蚜虫假酵母菌，这两个菌只在两个CD患者中分离到。当可培养的脂肪细菌按寄主状态分层时，我们发现了CDMAT所独有的细菌的亚群：无害芽胞梭菌，狄氏副拟杆菌，共生梭菌和长双歧杆菌(图3A)。为了排除人为培养细菌的影响，作者考察了这个特征是否可以区分CD和健康组织，特别是区分元基因组数据集中的CrF和HMAT。通过比较这些微生物的丰度，计算这5个CD专一性细菌的丰度与P.merdae丰度的对数比，此对数在元基因组测序基于Songbird多项式回归与健康对照的关联度最高，可以得出可培养的CD特征在CD和H组织之间有显著的区别(图3C)。在这一CD联合体中，分离频率最高的是无害芽胞梭菌。它的特征是革兰氏阳性菌，对万古霉素耐药，是共生微生物群中形成孢子的成员，是引起肠外梭状芽胞杆菌感染的第二常见物种，仅次于产气荚膜梭菌。有趣的是，可以从UC患者的MUC中分离出活的无害芽胞梭菌，但无法从他们的MAT中分离出，即使找到了其他活细菌(表S5.1)，证明了无害芽胞梭菌可以定植在回肠和结肠中，作者也无法从HMAT或者MUC中分离活的无害芽胞梭菌。
4分离自不同组织无害芽胞梭菌的比较基因组和功能分析
对来自30个患者的MUC和MAT的无害芽胞梭菌进行了全基因组测序，以模式菌株无害芽胞梭菌dsm和无害芽胞梭菌作为参考，以确定不同组织部位的菌株变异程度。结果显示各分离株之间最明显的系统发育差异是MUC和MAT来源的菌株之间的差异(图3D)。MUC和MAT分离株以及CDCrF和CDMATs分离株之间的KEGG通路存在差异，与感染性疾病、折叠、分类和降解、碳水化合物代谢和核苷酸代谢有关(图3E)。其中感染途径值得一提，它只有两个关键基因参与KEGG途径，即丝蛋白B(OGUc和c)和精氨酸酶(OGUc、c和c)。这些特征表明CD脂肪环境对最有能力调节宿主防御能力的无害芽胞梭菌施加了选择压力。通过厌氧底物利用率测定考察具有系统发育相似性的无害芽胞梭菌是否在功能具有相似性。与全基因组测序数据相似，该检测既揭示了核心功能特征，也揭示了可区分组织来源的可变特征。在保守功能中，除L-苯丙氨酸-9外，没有一株无害芽胞梭菌能有效利用氨基酸或它们的衍生物，而所有的菌株都能高效地代谢糖和糖衍生物，以及核苷酸及其衍生物(图3F)。尽管我们发现只有2/5的CD患者在其配对的CrF和MAT中有遗传分化的无害芽胞梭菌，但从功能上讲，从同一患者复活的CrF和MAT分离株都有不同的代谢偏好，且所有五名患者都符合该规律。除此之外，CDMUC和MAT分离株在底物偏好上的明显差异。具体地说MUC分离株比MAT分离株能更有效地代谢丙酮酸，这可能反映了这些组织中的氧分压。这些数据显示了MUC和MAT分离株在基因组水平上的明显差异；然而，功能分析揭示了这些菌株细微差别的底物偏好，可能反映了CrF组织中为适应环境发生的变化。
图三：CDMAT具有独特的以无害芽胞梭菌为优势种的可培养微生物群。
5尽管屏障功能受损但CD中细菌产物的系统循环减弱
接下来考察了宿主环境如何促进CrF中细菌移位和脂肪扩张。首先推测细菌易位的变化是否可以归因于肠道通透性的差异，于是检测了CDiMUC和uMUC，UCiMUC和uMUC，UCiMUC和uMUC和以及HMUC样本中JAM-A，MUC1,tricellulin,和ZO-1的基因表达(图4A)。与H组比较，CD和UC病例所有的生物标记蛋白，除了MUC1外均显著降低。这与已报道的人类IBD中MUC1的过度表达是一致的。在每个IBD患者的配对样本中的比较显示，CDiMUC与CDuMUC相比，除MUC1和ZO-1外，所有检测到的屏障基因的表达都较低(图S3C)。尽管屏障基因在CD和UC受累组织中的表达持续受损，但CD患者的血浆脂多糖结合蛋白(LBP)和可溶性CD14(与血液中循环细菌产物的数量成比例相关的肠道通透性替代标志物)的测量结果与UC相比显著降低，与HMUC相比没有显著差异(图4B)。这可能反映了宿主的炎症状态，CD和UC疾病的区域差异，也可能是CD中CrF的存在抑制了炎症病变部位细菌的全身扩散。
6无菌小鼠无害芽胞梭菌易位到MAT并促进脂肪扩张
由于目前不能预测哪些新诊断的CD患者会发生纤维化并发症，而且手术切除仅发生在晚期病例，因此，无法前瞻性地观察这些患者的细菌移位和CrF的发生发展情况。也没有任何慢性肾功能衰竭的动物模型可以可靠地重述在人类中看到的现象。因此，作者利用无菌小鼠，采用改变的舍德勒菌群(ASF)饲养系统来研究无害芽胞梭菌是否移位到MAT上，及对MAT的影响。ASF小鼠一次性口服人CrF来源的无害芽胞梭菌，并在灌胃后第4天确认其定植。在灌胃后第14天处死小鼠，同时处死灌胃PBS对照组小鼠。一组无害芽胞梭菌灌胃的小鼠被给予DSS以又到屏障功能受损。结果，我们观察到灌无害芽胞梭菌的小鼠有大量的肠系膜脂肪，而对照组小鼠有微量的MAT，类似于典型的无菌小鼠(图4C)。观察到的MAT扩张似乎不是整体体重增加的结果，因为无害芽胞梭菌并没有使体重增加(图4D)。虽然正如DSS治疗所预期的那样，无害芽胞梭菌+DSS组观察到明显的体重减轻，但与对照组相比，这些动物仍然表现出明显的脂肪肥胖症。结肠长度缩短是肠炎的一个指标，在两个组都有明显的观察到，无害芽胞梭菌+DSS组更明显(图4E)。通过对这些小鼠的MAT组织的培养，成功地分离出了灌胃的无害芽胞梭菌，证实它可以从肠道转移到MAT，并发生在DSS处理组和未处理组(图4F，蓝色箭头，指向无害芽胞梭菌)，这表明炎症不是其移位的先决条件)。作者还证明了，与来自健康人体组织对照的培养数据类似，细菌移位到MAT在一定程度上是一种自然发生的现象。我们从对照组复活了八种ASF中的两种菌(图4F，左，*色右排)，这表明并不是所有的微生物都有能力在肠外空间移位或存活，这与图3A和3B中的患者数据是一致的。有趣的是，无害芽胞梭菌的定植似乎促进了ASF内另外四个成员的移位(图4F，中间和右侧，*色箭头)，在DSS治疗组也观察到类似的结果。脂肪生成和组织纤维化相关基因的表达显示，单独灌胃无害芽胞梭菌的小鼠可上调FABP4、FASN、PPARG和CEBPA等脂肪生成相关基因的表达(图4G)。在无害芽胞梭菌+DSS组和对照组中未观察到这一现象。然而，常与脂肪纤维化有关的细胞外基质(ECM)成分IV型和VI型胶原在灌胃无害芽胞梭菌的小鼠±DSS中高表达(图4G)，提示无害芽胞梭菌在促进脂肪生成和细胞外基质产生方面具有一定的作用。为了验证MAT的扩张可以减弱细菌产物的系统性传播的假设，作者测量了不同治疗组的血浆LBP。结果发现，与未经治疗的ASF对照组相比，单独服用无害芽胞梭菌的组的LBP水平相似(图4H)，这与人类队列的结果(图4B)有所不同。另一方面，DSS处理的小鼠，尽管无害芽胞梭菌移位和MAT扩张，但其LBP水平仍显著增加。鉴于急性DSS会导致整个小肠和结肠的损伤，微生物产物的渗漏或扩散可能发生在脂肪膨胀区域之外。这个实验中的低重复度值有一定的局限性)，然而这些数据代表了一个概念性的证明，即人的CrF来源的无害芽胞梭菌在进入具有简化微生物群的无菌小鼠后，可以移位到MAT上，促进脂肪的扩张。
图四：无害芽胞梭菌易位促进MAT扩张并减弱细菌LPS的系统传播。
7CrF的细胞组成可被组织重塑的标记和不同的免疫细胞群来区分
为考察患者和对照组织中细菌移位到肠系膜的程度，作者还通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和批量RNA测序来表征CD、UC和H-MAT中MAT的细胞环境，并寻找区分跨组织和疾病的细胞表型。CrF和H-MAT的批量RNA测序显示，在检测到的个基因中，有个基因被鉴定为显著差异表达基因，其中个基因在CrF基因中上调，个基因在CrF基因中下调(图5A)。在CrF中脂肪生成相关的基因上调了而下调了负调控因子(图5B)。然而通路水平分析表明，CrF中最大的转录变化不是与脂质代谢有关的功能，而倍增分数最高的基因与细胞对细菌产物的反应、吞噬、B和T细胞的分化和活化以及细胞外基质的产生和组织等过程有关。这对应了CrF的主要特征是对细菌移位和纤维化的免疫反应。进一步深入分析，作者又对脂肪的基质血管组分进行了scRNA-seq，包含免疫细胞、内皮细胞和祖细胞类型。联合分析CrF和HMAT14个不同的细胞团(图5C，左)，主要由祖细胞(P1-P5)、免疫细胞和内皮细胞组成。当按组织来源(图5C，右)区分时，属于P3(FABP4+)的簇、两个T细胞亚群(T细胞1：CCL7+、CD62L+；T细胞2：CCL7、CD62L)、B细胞和感觉神经元几乎全部由CDCRF的细胞组成。相反，唯一能区分HMAT的细胞类型是P2(CD34+、FABP4+和PPARG+)和P4(ICAM1+)。这种与健康组织的比较证实CrF富含不同的免疫细胞。当CrF与其相邻的CDMAT在分离(Figure5D，左侧)，出现了11种细胞类型，但几乎全部由两个部位的细胞组成。在这11个细胞中，有3个是祖细胞类型(P1-P3)，它们的表型与以前的分析不同，因为它们在FABP4或PPARG中没有明显富集。虽然T细胞仍然是最丰富的免疫细胞类型，但与H-MAT相比，它们的异质性较小，B细胞显著扩张。当用CrF或CDMAT(图5D，右)显示这些簇时，相同的脂肪来源的成纤维细胞簇区分了HMAT和CrF，也可区分CDMAT(P2，簇1)。有趣的是，这种细胞类型也区分了CrF和UCMAT(簇P2，图S5A)，表明这种祖细胞类型是回肠区域MAT所特有的。
基因集富集分析确定了与HMAT或CDMAT相比，CrF显著富集的途径(图6A和B)。结果表明，与ECM产生相关的途径在祖细胞中有明显富集。这与大量RNA测序数据一致，虽然CrF富含脂肪合成基因，但ECM和免疫相关途径是最主要的。巨噬细胞群体中富集的重要途径主要与微生物模式识别和向其他类型细胞发出信号有关。然而，巨噬细胞也是内皮细胞外唯一上调脂质分解代谢和生物合成途径的细胞类型，表明它们在CrF的组织重塑中起作用。
图五：来自CD，UC和H的MAT的单细胞和批量RNA测序揭示了CrF中不同的细胞谱。
图六：上调的ECM和抗微生物相关途径是CrF的主要细胞表型。
8无害芽胞梭菌促进原代巨噬细胞和祖细胞的促纤维化表型
迄今为止的数据表明CrF是一种由促纤维化的祖细胞、适应性免疫细胞和先天免疫细胞共同控制的组织，这些细胞似乎共同受到细菌易位的影响。为了测试无害芽胞梭菌是否特异性地诱导这些反应，作者首先进行了免疫性试验，将CrF和CD来源的无害芽胞梭菌的新鲜裂解物与健康志愿者的PBMC来源的巨噬细胞共培养，并测量了指示M1或M2极化细胞的细胞表面标记和细胞因子。这些实验中使用的无害芽胞梭菌菌株与无菌小鼠实验中使用的菌株相同。同时，测试了无害芽胞梭菌作为选定的CD特异性可培养细菌(图3B)的一部分，可使巨噬细胞极化，类似于单独使用无害芽胞梭菌。巨噬细胞在分化为M1或M2亚型时表现出形态变化，M1表现出典型的圆形、尖状形态，M2形成细长的纺锤体。事实上，当暴露在LPS和IL-4、M1和M2阳性对照中时，也可以观察到这些形态(图7A，显示的代表性图像)。当这些细胞单独暴露于无害芽胞梭菌时，它们表现出明显的拉长形态，而暴露于CD相关联合体的巨噬细胞则是异质的。还在scRNA-seq数据集中使用了共表达的标准M1巨噬菌体标记，以及使用M2a/M2b/M2c亚集进行亚层化的M2标记来测量偏振态。在这些实验中，我们还从CD联合体中剔除了无害芽胞梭菌，从而清楚地描绘了所观察到的M1和M2形态的细菌。结果发现无害芽胞梭菌激发的最小M1反应显著低于LPS阳性对照，且与未激发的或IL-4阴性对照没有差异(图7B)，而CD群在所有处理组中诱导了最高的IL1β和TNFα反应。M2标记物分析表明，炎症反应的M2巨噬细胞M2B可被LPS和CD联合刺激，但不受无害芽胞梭菌分离株的刺激。然而，无害芽胞梭菌显著增加CD的表达，但不增加CD的表达，提示无害芽胞梭菌可能选择性地促进促纤维化的巨噬细胞M2a的表达。这些数据表明，无害芽胞梭菌易位可能不是巨噬细胞中引发明显的促炎反应的原因。这可能是由于其逃避这些细胞的能力，这一点在所有的CrF无害芽胞梭菌菌株中由精氨酸酶的保守基因所证明的。，CDMAT中存在的无害芽胞梭菌可能促进M2表型，从而重塑脂肪环境。为了验证这一假设，作者从CDMAT中分离出原代成纤维细胞和脂肪来源的干细胞，将这些细胞直接暴露于无害芽胞梭菌裂解物或暴露于无害芽胞梭菌暴露的巨噬细胞条件培养液中。通过检测Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原和透明质酸合成酶1的基因表达发现，单纯的无害芽胞梭菌裂解物不足以调节这些基因中的任何一个；然而，巨噬细胞共培养的裂解物显著增加了Ⅰ型胶原的表达(p0.)，并有增加透明质酸合成酶1表达的趋势(图7c)。有限的标记物不能最终确定哪种祖细胞类型与我们观察到的脂肪纤维化直接相关；然而它表明无害芽胞梭菌需要一种免疫细胞介质来诱导其促纤维化作用。span=""
图七：无害芽胞梭菌促进祖细胞体外的M2巨噬细胞极化和伤口愈合反应。
总结
本研究的数据有助于阐明一个长期存在的问题，即人类CD中的CrF是有害的还是有益的，很可能两者兼而有之。最初是对肠道损伤和细菌传播的反应，有助于人体的保护性反应，并限制系统抗原暴露的附带损害，但在持续的微生物暴露中，似乎没有关闭开关。这种伤口愈合反应反过来会导致肠系膜脂肪显著纤维化，在切除回肠时，回肠也明显纤维化。这可能会保护身体免受全身性炎症，试图将炎症保持在局部；然而，未加缓解的扩张会对底层组织造成严重后果，包括CrF侵入肠壁。因此，减缓高危患者的肠道储存库的治疗策略可能为预防或减轻纤维化提供一条途径。
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